Среди широкого спектра задач судебной экспертной практики исследование костных останков зачастую связано с трудностями, обусловленными естественными факторами, такими как сама природа костной ткани, а также видоизменение объекта исследования в результате длительного пребывания в неблагоприятных для сохранности ДНК условиях внешней среды, что зачастую является предпосылкой для низких качественных и количественных характеристик выделяемой ДНК.
Костные клетки (остеобласты, остеоциты и остеокласты), являющиеся источником ДНК в костях, составляют всего лишь 2% костной ткани, тогда как значительная часть кости образована межклеточным матриксом, в котором 70% и более представлено неорганическими соединениями, преимущественно нерастворимыми кристаллами кальций-содержащих соединений. Несмотря на крайне малое содержание клеточных компонентов, а следовательно, и ДНК в костной ткани, зачастую только костные останки могут быть единственно доступным источником криминалистически значимой информации.
Деградация костных тканей после смерти организма (диагенез) обусловлена двумя ключевыми процессами. Первый происходит с участием микроорганизмов и протекает относительно быстро, особенно если останки находятся в аэробной среде, где оказываются легко доступны для разложения с участием микроорганизмов (бактерий и грибов). Второй процесс связан с химической деградацией компонентов кости и протекает значительно медленнее, наиболее важными факторами, влияющими на скорость этой составляющей, являются температура, влажность и pH. Исходя из вышеперечисленных факторов, есть возможность спрогнозировать вероятность сохранения ДНК в тех или иных объектах, а значить использовать эти знания при выборе конкретного объекта для исследования.
Классическая схема выделения ДНК из костных останков сводится к четырем этапам: пробоподготовка (выбор объекта исследования и очистка поверхности костного материала от остатков мягких тканей и внешних загрязнений), измельчение костной ткани с целью увеличения поверхности соприкосновения растворов с костной тканью), декальцинирование и лизис костной ткани и очистка выделенной ДНК.
До недавнего времени, в экспертных лабораториях для двух последних этапов использовались наборы западных производителей, являвшиеся проверенным решением для выделения ДНК из костей (PrepFiler BTA Forensic DNA Extraction Kit (Thermo Scientifiс, США) и Bone DNA Extraction Kit (Promega, США). В настоящее время по известным причинам применение вышеупомянутых продуктов является недоступным для нашей страны.
С целью импортозамещения, а в сложившихся пару лет назад, замещением вакуума по ряду позиций, отечественные компании активно включились в разработку всей линейки реагентов для производства полного цикла исследовательской части судебной генетической экспертизы. В том числе комплексное решение для исследования ДНК, содержащейся в костных останках, предлагает и наша компания.
Нашей компанией разработан набор для экстракции ДНК из костей - «ИмпульсСКЕЛ». В качестве референсного набора при разработке и валидации использовался набор для выделения одного из западных производителей. При этом были получены сопоставимые по эффективности использования результаты.
Так же нашей компанией был разработан протокол для станции автоматического выделения ДНК GenePure. Ниже представлены результаты сравнительного выделения одних и тех же зубов с использованием набора «ИмпульсСКЕЛ», в таблице маркировка "it" и “MAGABIO FORENSIC SAMPLE DNA PURIFICATION KIT, Китай” в таблице маркировка "b"
В основе принципа работы набора «ИмпульсСКЕЛ» лежит лизирование объекта исследования в среде деминерализационного буфера, с последующим связыванием ДНК на магнитных частицах и их отмывкой с элюированием выделенного продукта в пробу.
В ходе валидации была определена оптимальная для полноценного исследования навеска костного материала (50-150 мг), а также установлено время, достаточное для полного лизиса образца (2,5 часа).
Для этапа оценки качественных и количественных характеристик выделенной ДНК наша компания предлагает к использованию набор реагентов «ИмпульсМера». Данный набор позволяет получить достоверную информацию о концентрации ДНК человека в исследуемом объекте, степени ее деградации и половой принадлежности в рамках одной высокочувствительной реакции ПЦР в режиме реального времени. Для повышения чувствительности, достоверной оценки общей и мужской концентрации ДНК в исследуемом образце используются многокопийные фрагменты генома человека, что позволяет сократить время данного этапа до 45 минут.
Дальнейший этап исследования предполагает подбор подходящих средств для амплификации STR-локусов с учетом особенностей пробы, выделенной ДНК.
В качестве составлющей комплексного решения для исследования ДНК, выделенной из костной ткани, наша компания предлагает к использованию набор реагентов «ИмпульсТест А29». Во-первых, данный набор является весьма чувствительным, что важно при анализе проб, содержащих низкие концентрации ДНК. Во-вторых, данный набор хорошо себя зарекомендовал при работе с деградированной ДНК, поскольку 16 маркеров располагаются в пределах длин до 300 п.н. В-третьих, весьма интересной с точки зрения эффективности при исследовании сложных объектов, в частности ДНК, выделенной из костных останков, оказалась работа по возможному увеличению количества циклов ПЦР с целью наработки исключительно специфичного продукта
Таким образом, несмотря на общий характер подхода к выделению и дальнейшему исследованию ДНК из костных останков, применяемого в работе экспертов генетических лабораторий, правильный выбор средств и методов, применяемых на каждом из этапов исследования, оказывает решающее значение на конечный его результат. В общем и целом, это наглядный пример, подтверждающий выражение «мелочей в экспертной работе не бывает», поскольку весь процесс по выбору объекта исследования, исходя из оценки вероятной сохранности ДНК в нем, подбору эффективных средств для выделения и оценки ядерной ДНК в пробе, а также выбор реагентов для дальнейшего исследования с целью получения необходимой информации о конкретных аллельных характеристиках генетического профиля, можно рассматривать только в совокупности, направленной на успешное решение поставленной задачи.