В настоящее время современные коммерческие наборы разных производителей основаны на этом принципе, но, в то же время, могут иметь свои собственные характеристики. Эффективность процесса дифференциальной экстракции направлена на успешное извлечение ДНК из сперматозоидов, с одновременным сохранением ее в процессе разделения, чтобы гарантировать высокий выход. Кроме того, для обеспечения чистоты каждой из фракций взаимный перенос иных типов клеток должен быть сведен к минимуму.
При анализе традиционных образцов в случае преступлений сексуального характера, таких как гинекологические мазки и смывы, лаборатории судебной генетики стремятся установить профиль аутосомной ДНК мужчины-участника, чтобы помочь идентифицировать его источник, в том числе с использованием ФБДГИ.
Большинство применяемых методов дифференциального лизиса в случаях разделения спермальной и эпителиальной фракции достаточно трудоемки, а применяемые протоколы весьма длительны во времени, что, в целом ограничивает производительность. Общее время, необходимое для получения очищенного препарата ДНК из нескольких образцов, содержащих спермальный компонент в смеси с клетками жертвы, с использованием традиционных методов, составляет от 6 до 8 часов.
Разработка новых экспресс-методов, позволяющих быстро, легко и качественно получать результаты без дополнительного оборудования, является одной из приоритетных задач по разделению эпителиальной и спермальной фракций в случаях расследования преступлений против половой неприкосновенности. Одним из последних решений такого рода является SpermTrap™ (InnoGenomics Technologies), который позволяет получать пробы разделенных фракций, готовые к дальнейшему анализу с минимальными шагами за 2,5 часа.
Большинство применяемых методов дифференциального лизиса в случаях разделения спермальной и эпителиальной фракции достаточно трудоемки, а применяемые протоколы весьма длительны во времени, что, в целом ограничивает производительность. Общее время, необходимое для получения очищенного препарата ДНК из нескольких образцов, содержащих спермальный компонент в смеси с клетками жертвы, с использованием традиционных методов, составляет от 6 до 8 часов.
Разработка новых экспресс-методов, позволяющих быстро, легко и качественно получать результаты без дополнительного оборудования, является одной из приоритетных задач по разделению эпителиальной и спермальной фракций в случаях расследования преступлений против половой неприкосновенности. Одним из последних решений такого рода является SpermTrap™ (InnoGenomics Technologies), который позволяет получать пробы разделенных фракций, готовые к дальнейшему анализу с минимальными шагами за 2,5 часа.
Компания ООО ИмпульсТест разработала и внедрила в повседневную практику набор «ИмпульсСПЕП» для быстрого процесса дифференциальной экстракции из образцов с мест преступлений сексуального характера.
Данный набор позволяет эффективно разделять спермальную и эпителиальную фракции в образцах, изъятых с мест преступления сексуального характера, а также выделять ДНК из эпителиальной фракции. Компоненты, входящие в состав буфера, обеспечивают процесс разделения эпителиальной и спермальной фракций в смешанных образцах для эффективного последующего выделения ДНК из каждой из них.
Для выделения ДНК из спермальной фракции данный набор реагентов может использоваться в комбинации с набором «ИмпульсСтарт-Объект», «ИмпульсСОРБ» или «ИмпульсСпин».
Процесс дифференциальной экстракции ДНК представлен на схеме ниже:
Для оценки эффективности проведенного дифференциального лизиса логичным представляется определение качественных и количественных характеристик полученных проб (спермальной и эпителиальной фракции) методом проведения ПЦР в режиме реального времени.
Для решения данной задачи наша компания предлагает к использованию набор реагентов для количественного и качественного анализа «ИмпульсМера». Данный набор позволяет получить достоверную информацию о концентрации ДНК человека в исследуемом объекте, степени ее деградации и половой принадлежности в рамках одной высокочувствительной реакции ПЦР в режиме реального времени. Для повышения чувствительности, достоверной оценки общей и мужской концентрации ДНК в исследуемом образце используются многокопийные фрагменты генома человека.
Пример оценки данных с помощью набора «ИмпульсМера»:
Для решения данной задачи наша компания предлагает к использованию набор реагентов для количественного и качественного анализа «ИмпульсМера». Данный набор позволяет получить достоверную информацию о концентрации ДНК человека в исследуемом объекте, степени ее деградации и половой принадлежности в рамках одной высокочувствительной реакции ПЦР в режиме реального времени. Для повышения чувствительности, достоверной оценки общей и мужской концентрации ДНК в исследуемом образце используются многокопийные фрагменты генома человека.
Пример оценки данных с помощью набора «ИмпульсМера»:
Финальная этап экспертного исследования разделенных проб ДНК может производиться с помощью набора реагентов для амплификации и анализа STR локусов «ИмпульсТест A29». Данный набор предназначен для амплификации и последующей шестикрасочной детекции методом капиллярного электрофореза полспецифических локусов Амелогенин и Y indel, 24 аутосомных STR-локусов человека, а также трех STR-локусов Y-хромосомы. Наличие последних обеспечивает высокую эффективность в случаях расследования половых преступлений группового характера, поскольку уже на этапе анализа электрофореграмм спермальных фракций можно определить количество вкладчиков «мужской» ДНК и, в перспективе, определиться с дальнейшим направлением исследования (исследование STR-локусов Y-хромосомы). Вышеперечисленные особенности набора, наряду с высокой чувствительностью последнего, позволяют рассматривать данное решение в качестве оптимального для получения генетических профилей после процедуры дифференциального лизиса. Одновременно, стоит отметить, что для последующей амплификации полученных проб также можно использовать иные коммерческие наборы.
Ниже представлены результаты разделения ДНК из вагинального мазка, изъятого в ходе медицинского освидетельствования жертвы группового изнасилования, хранившегося перед исследованием в течении 3 месяцев при комнатной температуре. Эпителиальная (Ep) и спермальная (Sp) фракции из вагинального мазка были разделены и лизированы с помощью наборов «ИмпульсСПЕП» и «ИмпульсСтарт-Объект». ДНК была амплифицирована с помощью набора «SF25 STR Kit» в соответствии с рекомендуемым протоколом. Капиллярный электрофорез проведен на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500. Результаты были проанализированы на GeneMapper ID-X v. 1.6 с порогом 150 RFU.
Дифференциальный лизис является одним из самых трудоемких и дорогостоящих методов в судебно-медицинской практике ДНК анализа. Однако, важность этого процесса трудно переоценить, поскольку он является ключевым инструментом для раскрытия преступлений сексуального характера.
Важной особенностью проведения данного процесса с использованием набора реагентов «ИмпульсСПЕП» является возможность исследования большого количества образцов без значительного увеличения времени, затраченного на этап разделения фракций и выделение ДНК из них, которое составляет около 90 минут до получения готовых к дальнейшему анализу лизатов.
Оценка результатов валидации предлагаемого решения и обобщение опыта внедрения данного подхода в лабораторную деятельность профильных экспертных подразделений показала, что протокол позволяет качественно разделять фракции спермы и эпителия, обеспечивает чистоту разделенных фракций и высокие качественные и количественные характеристики выделенных проб.
Таким образом, рассмотренный новый подход к столь важному и весьма сложному в лабораторном исполнении дифференциальному лизису использует простой и быстрый протокол, имеет высокие производительность и эффективность, что позволяет рассматривать его в качестве достойной альтернативы традиционным классическим методам исследования объектов при раскрытии и расследовании преступлений против половой неприкосновенности личности.
Важной особенностью проведения данного процесса с использованием набора реагентов «ИмпульсСПЕП» является возможность исследования большого количества образцов без значительного увеличения времени, затраченного на этап разделения фракций и выделение ДНК из них, которое составляет около 90 минут до получения готовых к дальнейшему анализу лизатов.
Оценка результатов валидации предлагаемого решения и обобщение опыта внедрения данного подхода в лабораторную деятельность профильных экспертных подразделений показала, что протокол позволяет качественно разделять фракции спермы и эпителия, обеспечивает чистоту разделенных фракций и высокие качественные и количественные характеристики выделенных проб.
Таким образом, рассмотренный новый подход к столь важному и весьма сложному в лабораторном исполнении дифференциальному лизису использует простой и быстрый протокол, имеет высокие производительность и эффективность, что позволяет рассматривать его в качестве достойной альтернативы традиционным классическим методам исследования объектов при раскрытии и расследовании преступлений против половой неприкосновенности личности.