Наряду с последними, в качестве источника ДНК проверяемого лица, могут выступать и образцы тканей, изъятые в рамках судебно-медицинского исследования трупа или в ходе проведения медицинских диагностических мероприятий, и зафиксированные в парафиновых блоках для гистологических исследований.
Такой биологический материал несет генетическую информацию о человеке и может использоваться для медико-биологических исследований, а также для установления родства, идентификации личности и других целей. Нередко патогенез различных заболеваний изучают с использованием ДНК из гистологического материала больных.
Процесс изготовления парафиновых блоков включает несколько этапов, включая фиксацию (дегидратацию) и закрепление в парафине, что приводит к разрывам в молекуле ДНК и, как следствие, к ее фрагментации, значительно снижающей количество ДНК, пригодной для полноценного использования в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Несмотря на большое количество решений для выделения ДНК из парафиновых блоков, до сих пор не существует общепринятого единого протокола пробоподготовки. Это приводит к тому, что качество препаратов ДНК и количество ДНК, получаемое из парафиновых блоков, сильно варьируют, а иногда и к дискордантности данных, получаемых в результате анализа одного и того же объекта в различных лабораториях.
Для анализа ДНК биологического материала, фиксированного в парафиновых блоках нашей компанией предлагается следующее комплексное решение, на каждом из этапов которого учтены особенности и сложности при работе с такого рода объектами.
Для выделения ДНК предлагаем к использованию набор реагентов «ИмпульсСтарт-FFPE». Протокол работы с данным набором предполагает два варианта выделения: с предварительной депарафинизацией и без таковой. Следует отметить, что протокол депарафинизации при ее проведении исключает использование токсичного ксилола. Кроме того, как показали сравнительные исследования при валидации данного набора, нет существенной разницы в качественно-количественных характеристиках проб ДНК, полученных с предварительной депарафинизацией или без нее.
Сам же протокол выделения выгодно отличается от традиционных подходов. Во-первых, работа «ИмпульсСтарт-FFPE» предполагает первоначальный этап температурной инкубации в среде специального подготавливающего буфера, что повышает качественные характеристики высвобождающейся в процессе непосредственного лизиса ДНК. Во-вторых, непосредственно процесс выделения ДНК исключает дополнительную очистку выделяемой ДНК на магнитных частицах или колонках и представляет собой двух стадийное инкубирование в среде лизирующего буфера с добавлением ферментов. Заключительный этап включает температурную инактивацию последних. Таким образом, учитывая укороченное время выделения (1,5 часа) и минимум ручных манипуляций, данный продукт кратно увеличивает пропускную способность лаборатории при работе с фиксированными тканями в парафиновых блоках.
Для этапа оценки качественных и количественных характеристик выделенной ДНК наша компания предлагает к использованию набор реагентов «ИмпульсМера». Данный набор позволяет получить достоверную информацию о концентрации ДНК человека в исследуемом объекте, степени ее деградации и половой принадлежности в рамках одной высокочувствительной реакции ПЦР в режиме реального времени. Для повышения чувствительности, достоверной оценки общей и мужской концентрации ДНК в исследуемом образце используются многокопийные фрагменты генома человека, что позволяет сократить время данного этапа до 40 минут.
Дальнейший этап исследования предполагает подбор подходящих средств для амплификации STR-локусов с учетом особенностей пробы выделенной ДНК.
В качестве составляющей комплексного решения для исследования ДНК, выделенной из фиксированных тканей, наша компания предлагает к использованию набор реагентов «ИмпульсТест А29». Во-первых, данный набор является весьма чувствительным, что важно при анализе проб, содержащих низкие концентрации ДНК. Во-вторых, данный набор хорошо себя зарекомендовал при работе с деградированной ДНК, поскольку 16 маркеров располагаются в пределах длин до 300 п.н. В-третьих, весьма интересной с точки зрения эффективности при исследовании сложных объектов, в частности ДНК, выделенной из костных останков, оказалась работа по возможному увеличению количества циклов ПЦР с целью наработки исключительно специфичного продукта.
На электрофореграмме ниже представлен генетический профиль ДНК (набор «ИмпульсТест А29»), выделенной из фрагмента ткани в парафиновом блоке набором «ИмпульсСтарт-FFPE» без предварительной депарафинизации.
